Microorganismos presentes en Almidon Papa Criolla: septiembre 2009

Microorganismos en una muestra de Almidon de papa Criolla

Trabajo Realizado Por Estudiantes De Tecnología En Química Industrial del SENA En Cuanto A La Identificación Microbiana De Los Microorganismos Posibles, En Una Muestra De Almidón De Papa Criolla.

Grupo: 5TGQIN2

Integrantes:

Jennifer Guaidia

Carolina Moreno

Lyan Cuestas

Derly Vargas

Diego Patiño

Diego Morales

Objetivo general

Determinar la presencia de distintos microorganismos en el almidon de la papa criolla

Objetivos

Realizar la preparación de diferentes medios de cultivo (nutritivo y PDA).
Conocer la importancia de la esterilización de los medios de cultivo y los materiales en el plan de aislamiento.
Realizar diferentes técnicas de aislamiento para obtener un cultivo puro de microorganismos.
Identificar microscópicamente y macroscópicamente los distintos microorganismos y hacer el respectivo conteo.
Realizar pruebas bioquímicas para identificar los distintos microorganismos.
Aprender a interpretar pruebas bioquímicas de identificación bacteriana.

Introducción

En este blog se encuentra todos los pasos y documentación utilizada para elaborar la Identificación Microbiana de los Microorganismos Presentes en una Muestra de Almidón de Papa Criolla.

En la primera parte encontraremos temas referentes a muestra que vamos a determinar, tipos de microorganismos, medios de cultivos, soluciones diluyentes, reactivas y colorantes, equipos, y los objetivos de esta práctica en general.

En la segunda parte podemos ver los pasos y parámetros para preparar los medios de cultivo, agregando también un diagrama de flujo que nos podría facilitar esta practica. Mas adelante podemos localizar las diluciones que se realizaron, un diagrama de flujo con cada uno de los pasos que se siguieron y adjunto a esto unas imágenes que nos enseñan cada unas de las siembras que creamos.

Por otra parte se hará referencia a la técnica de re cuento en placa y se mostraran algunas imágenes de esta práctica.

Para analizar mas a fondo que tipos de microorganismos han surgido de estas siembras desarrollamos una Descripción Macro y Microscópica a cada una de las colonias existentes, en la cual se dan todas las características posibles en cuanto a su tamaño, su forma, su color, fotos etc.

Se analizara también el concepto de Aislamiento de Cultivo axeníco y toda su metodología con unas gráficas que nos pueden servir para facilitar la práctica.

Finalmente encontraremos la descripción de cada unas de las pruebas bioquímicas que realizamos para especificar mas características del el microorganismo que se encuentra en el almidón.

Desarrollo Teórico

Almidón

es un polisacárido de reserva alimenticia predominante en las plantas,constituido por amilasa y amilopectina.Proporciona el 70-80% de las calorías consumidas por los humanos de todo el mundo. Tanto el almidón como los productos de la hidrólisis del almidón constituyen la mayor parte de los carbohidratos digestibles de la dieta habitual. Del mismo modo, la cantidad de almidón utilizado en la preparación de productos alimenticios, sin contar el que se encuentra presente en las harinas usadas para hacer pan y otros productos de panadería.

Caldo nutritivo

Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el desarrollo de microorganismos con escasos requerimientos nutricionales.

Su uso está descrito en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.

Fundamento

Medio no selectivo, contiene pluripeptona y extracto de carne que constituyen la fuente de carbono y nitrógeno necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano.

Puede ser utilizado además, como preenriquecimiento en la búsqueda de Salmonella spp. a partir de alimentos, ya que permite recuperar células dañadas, diluir metabolitos tóxicos y sustancias inhibitorias.

Siembra:

Por inoculación directa de la muestra o del microorganismo en estudio.

Incubación:

En aerobiosis, a 35-37 ºC durante 24 horas.

Agar nutritivo

Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos.

Su uso está descrito en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.

Fundamento

Por las características de sus componentes es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrógeno para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes.

Siembra:

En superficie o por la técnica de pour plate, según el uso a que se destine.

Incubación:

En aerobiosis, a 35-37 ºC durante 24 horas.

PDA para hongos (Potato Dextrosa Agar)

El medio PDA tiene en su formulación dextrosa como fuente carbonada, este compuesto lo hace selectivo para hongos ya que sólo éstos pueden degradarlo, si tuviera otra fuente de carbono como glucosa también crecerían bacterias.

Para la elaboración del medio PDA, el procedimiento es mucho más sencillo puesto que ya está comercializado en polvo y sólo es necesario disolverlo en agua destilada (en las proporciones adecuadas) y agitar.

Incubación:

Incubar las placas sin invertirlas a temperatura de salón (20-240C) en luz, pero evitar que sea directa. Examinar y contar las colonias en las placas luego de 3, 5 y 7 días.

Conteo e inventario:

El conteo de hongos en una placa proveerá la base para comparaciones cuantitativas entre muestras tomadas en distintas localidades. El inventario nos hablará de la abundancia de especies de hongos en la zona. Descartar placas con más de 300 colonias.

Se puede calcular el número de hongos por volumen de agua en las muestras y así comparar varios sitios muestreados.

# de hongos/ ml de muestra = suma del número de colonias en las 5 placas X dilución de una misma dilución

Para realizar un inventario se deberá utilizar el microscopio para ver morfología y estructuras reproductivas que ayuden en la clasificación de las especies.

Preparacion Medio de Cultivo

MEDIO DE CULTIVO AGAR NUTRIVO

• El frasco de agar nutritivo dice 23 g/l.

• Y nosotros queremos preparar aproximadamente 200 ml, ya que a cada caja se le va a agregar aproximadamente 15 a 20 ml. Se va a pesar 4.6 gr. de agar nutritivo en la balanza.

• Se agregan inicialmente 50 ml de agua peptonada al erlenmeyer de 200 ml y se le agrega el agar, después se agregan los 100 ml de agua restantes.

• Después se pone a calentar el agar que hay en el erlemeyer, dándole vueltas sobre la llama, hasta que quede transparente a eso se le llama clarificar el agar.

• Se deja enfriar y se pone en una autoclave, para que se esterilice el agar y poder agregarlo en las cajas petri, una vez que haya llegado a 121 ºC, se comienza a contar 15 minutos y se deja enfriar.

• Luego se agarra el erlenmeyer tendiendo cuidado que no este muy caliente, pero tampoco frió ya que puede melificarse.

• se prende el mechero y a una cercanía aproximadamente de 30 cm alrededor, se ponen las cajas, se flamea la boca del erlenmeyer y se agrega a cada caja aproximadamente 15 ml de agar, se cierra la caja y se asienta hasta que gelifique.

• Una vez estén listas todas las cajas petri se espera que gelifiquen.

MEDIO DE CULTIVO AGAR PDA

-El frasco de PDA en polvo dice 39 g/L, entonces pesamos 7,8 gr. Y se sigue el mismo procedimiento de agar nutritivo.

-El procedimiento para el llenado de las cajas Petri es el siguiente:

-El recipiente que contiene el medio de cultivo se destapa, evitando tocar la boca del frasco, el cual debe pasarse sobre la llama de una lámpara de alcohol.

-La tapa de la caja de Petri se abre únicamente lo necesario para colocar sobre ella la boca del recipiente que contiene el medio de cultivo y se dispensa de 20 a 25 ml del líquido.

-La caja de Petri y el recipiente se tapan. La caja se agita con movimientos de rotación para que el medio de cultivo se distribuya uniformemente.

-El medio del cultivo debe solidificarse antes de usarse.

Dilucion

Las Diluciones que se realizaron fueron del orden de:

10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4.

se mezclo el almidón con el agua peptonada en un bicker
con una pipeta se llevaron diferentes volúmenes a los tubos de ensayo
se realizo la dilucion en las tubos de ensayo en el orden que esta descrito en el diagrama
se procedió a la siembra.

Siembra del Cultivo

Para la siembra seguimos el siguiente proceso:

esta siembra se dejo en incubación en diferentes intervalos por ser diferentes tipos de Agar y esperando cultivos de diferentes tipos de microorganismos, se continuo con el recuento en placa.

la siembra de 10^-2.

la siembra de Agar Nutritivo 10^-4.

Recuento en Placa

Técnica que nos permitió determinar la cantidad de microorganismos presentes en las cajas petri, basándose en su crecimiento y desarrollo en forma de colonias, en un medio de cultivo específico en placa.

Como las colonias pueden originarse tanto a partir de una célula como de un grupo de células, se utiliza el término “unidades formadoras de colonias (ufc)”.

Se encontraron por medio de este método ocho unidades formadoras de colonias con distintas características morfológicas, dándole a estas (nutrientes, atmósfera temperatura…).

Aqui se observa como se hizo el conteo de las colonias.

Descripción Macro y Micro

Macro:

se tomaron los siguientes aspectos para la identificación macroscopica:

FORMA: Puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa, rizoide, etc.
TAMAÑO: Estimar el diámetro en mm.
SUPERFICIE: Lisa, rugosa, cerebriforme, en anillos concéntricos, etc.
ELEVACION: Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, umbilicada.
BORDE: Continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festoneado, filamentoso.
ESTRUCTURA INTERNA: Amorfa o granulosa.
COLOR: Según sea observado por la luz reflejada o por la luz transmitida, puede ser de color blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc.
OPACIDAD: Transparente, opaca, etc.
CONSISTENCIA: Dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa, etc. Usar el Asa bacteriológica para determinar la consistencia.

MICRO:

primero se hizo una tincion de gram y luego se observo las colonias mas representativas de nuestro cultivo, para identificar una de las siguientes morfologias.

En el microoscopio pudimos identificar los siguientes microorganismos:

se podria decir que aqui se obsrvo cocos, pero por ser un poco mas grandes en tamaño es levadura.

Esta es una de las estructuras filamentosas de la identificación macroscopica, se puede identificar como un moho.

En esta se puede identificar un grupo de bacilos.

Tambien aqu hay presencia de levaduras.

Como Resultado podemos definir las descriciones en el siguiente cuadro:

Clic para ver mejor.

TINCION DE GRAM

Comportamiento de los dos tipos de microorganismos en una tinción de gram.

De Esta Forma se realizo la tinción:

AGAR 10^-2

COLONIA 1.

COLONIA 2.

COLONIA 3.

COLONIA 4.

PDA 10^-4

COLONIA 5.

PDA 10^-2

COLONIA 6.

COLONIA 7.

AGAR 10^-5

COLONIA 8

Aislamiento cultivo Axénico

Se realizo el siguiente procedimiento:

TÉCNICA aislamiento

1. Tomar el cultivo bacteriano y en condiciones asépticas obtener una asada del material.

2. Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la caja de Petri y descargar el material en el sector 1, trazando una serie de zig-zags muy cerrados a todo lo ancho del sector. Cerrar la caja.

3. Esterilizar el asa flameándola y mientras que se enfría, girar la caja 90° hasta que el sector 1 quede a la izquierda y el 2 hacia arriba a la derecha.

4. Trazar unos 5 zig-zags en el sector 2 invadiendo el sector 1 para llevar un poco de material al sector 2 y las siguientes estrías no deben tocar el sector 1. En esta forma se diluye el material quedando unas bacterias separadas de las otras.

5. Esterilizar de nuevo el asa, girar la caja 90° y ahora el sector 2 estará a la izquierda y el 3 a la derecha.

6. Trazar unos 5 zig-zags en el sector 3 invadiendo el sector 2 y el resto sin tocar el sector 2, como se muestra en el dibujo:

7. Incubar a 37°C por 24-48 horas.

8. Observar si hubo o no, aislamiento de colonias.

9. Anotar las características de las colonias aisladas.

10. Inocular a partir de las colonias aisladas los tubos de agar inclinado, por estría, para obtener cultivos puros.

11. Incubar a 37°C por 24-48 horas.

12. Después de este período observar si efectivamente hubo crecimiento de un solo tipo de microorganismos.

15. Preparar un frotis, teñir con la técnica de Gram y observar al microscopio con objetivo de inmersión para confirmar su pureza.

16. Dibujar las observaciones hechas al microscopio.

17. Guardar los cultivos puros en el refrigerador para su posterior clasificación e identificación.

NOTAS: Siguiendo la misma técnica, la caja de agar se puede dividir en más de 3 sectores, obteniendo una dilución mayor, como se muestra en el dibujo:

Pruebas Bioquimicas

PARA LAS PRUEBAS DE KLIGER:

Se aislaron bacilos esporulados y bacilos de la caja de petri 10^-5 en tres tubos de ensayo respectivamente En ninguno se presentó crecimiento de colonia, pero los tres tomaron coloración amarilla, tanto en el pico de flauta donde se identifica la fermentación de lactosa, como en el fondo del tubo donde se identifica la fermentación de glucosa, en ninguno de los tubos hay presencia de sulfuro de hidrógeno, ya que no se observa la presencia de ningún precipitado negro. Después de la incubación en los tubos donde se cultivaron los bacilos esporulados y bacilos de una de las colonias de la caja de 10^-5, no se identifica la presencia de gas, ya que no se observan burbujas o desprendimiento del agar; mientras que en el tubo donde se incubó otra colonia de bacilos de la caja petri 10^-5, si se observo desprendimiento del agar, ocasionado por la fermentación de la glucosa, que al igual que la fermentación de la lactosa, producen la variación del pH tanto en la superficie como en el fondo del tubo, lo que ocasiona el viraje de color de rojo a amarillo, que indica la formación de ácidos.

PARA LAS PRUEBAS DE TSI: Para TSI, sembramos en cuatro tubos diferentes, levaduras rosadas, levaduras blancas, bacilos y bacilos esporulados respectivamente. En el tubo de levaduras rosadas, encontramos que tanto el fondo como el pico del tubo se encuentran amarillos, lo que indica que el cultivo se encuentra en un pH acido, e identificamos que los microorganismos fermentan glucosa, lactosa y/o sacarosa. En el tubo de levaduras blancas encontramos, pico y fondo amarillo, que indica que el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa y también hay un pH ácido, además de observa un rompimiento en el agar que nos indica que el microorganismo produce gas. En el tubo de TSI para los bacilos observamos que el pico y el fondo se encuentran amarillos, es decir, que el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa y también esta en un pH ácido. En el tubo de TSI para los bacilos esporulados observamos que el pico se encuentra rojo, pH alcalino y el fondo amarillo, pH ácido, lo que quieres decir que le microorganismo solo fermenta glucosa. En ninguno de los tubos se observa presencia de sulfuro de hidrogeno, que se identifica como un precipitado negro.

PARA LAS PRUEBAS DE CITRATOS: En el medio de citrato cultivamos bacilos y bacilos esporulados, en donde la reacción fue negativa debido a que no hubo ningún cambio de coloración en el indicador, es decir, no hubo un viraje de verde a azul, porque no es utilizado el citrato y el indicador de pH (azul de bromotimol) permanece de color verde y tampoco hay crecimiento de microorganismos.

PRUEBAS DE SIM: Para la prueba de SIM, se cultivaron bacilos esporulados y bacilos de la caja petri 10^-5, donde no se observa la presencia de sulfuro de hidrógeno, porque no hay precipitado negro en los tubos, mientras que en el tubo de bacilos esporulados no se observo motilidad, en la de la caja petri 10^-5, si se observo diseminación de la opacidad bacteriana a partir del trayecto de la picadura de inoculación. El medio es amarillo lo que indica que no libero indol, ya que la bacteria no tiene triptofanasa